基因人最近收到不少老師和同學(xué)們對(duì)水平電泳的小疑惑——TAE和TBE兩個(gè)緩沖液有什么區(qū)別啊？100bp的DNA用多少濃度的膠檢測(cè)??？水平電泳一般用多大電壓跑?。?#8230;…
是時(shí)候給大家講講水平電泳的那些小問(wèn)題了！不過(guò)估計(jì)大多數(shù)人都知道，不用再看了。
1 電泳方式
用于分離核酸的凝膠電泳可分為垂直型和水平型。垂直型電泳，一般用聚丙烯酰胺作為支撐物。水平型電泳，凝膠板*浸泡在電極緩沖液下1-2mm，也稱(chēng)為潛水式，一般使用瓊脂糖作為支撐物?？筛鶕?jù)待檢測(cè)核酸分子的大小，選擇電泳方式。
目前使用更多的還是水平型電泳。因制膠和加樣比較方便，電泳槽簡(jiǎn)單，易于制作，又可根據(jù)需要制備不同規(guī)格大小的凝膠，節(jié)約凝膠，因而較受歡迎。
2 電泳凝膠濃度與檢測(cè)分子量大小的關(guān)系
在一定濃度的瓊脂糖凝膠中，DNA-pian段遷移距離和其含有的堿基對(duì)數(shù)量呈反比，因此可通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)條帶（Marker）遷移距離進(jìn)行比較，由此得出目的條帶的大小。但此檢測(cè)方法，僅對(duì)雙鏈線性DNA比較準(zhǔn)確（DNA Marker一般為雙鏈線性DNA）。
同樣的線性DNA分子在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的遷移速度不同，DNA電泳遷移率的對(duì)數(shù)和瓊脂糖凝膠濃度呈線性關(guān)系，凝膠濃度的選擇取決于待檢測(cè)的DNA分子大小。小分子DNA應(yīng)選擇對(duì)應(yīng)濃度的PAGE凝膠電泳完成檢測(cè)，而更大的DNA分子建議使用脈沖場(chǎng)凝膠電泳。
3 核酸分子構(gòu)象與電泳遷移率的關(guān)系
DNA分子在電場(chǎng)中的遷移速度不僅和分子量有關(guān)，還和它本身的構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線性、開(kāi)環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中的移動(dòng)速度是不一樣的。移動(dòng)速度次序?yàn)椋汗矁r(jià)閉環(huán)DNA>線性DNA>開(kāi)環(huán)DNA。
當(dāng)瓊脂糖濃度太大時(shí)，環(huán)狀的DNA一般不能進(jìn)入膠內(nèi)，而停留在樣品孔中。
4 電泳電壓的確定
在低電壓時(shí)，線性DNA-pian段的遷移速率和所加電壓呈正比。電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。
電泳時(shí)，電壓建議為5-8V/cm。電壓過(guò)低會(huì)導(dǎo)致條帶彌散；電壓過(guò)高會(huì)使凝膠過(guò)熱和DNA變性，還可能出現(xiàn)條帶彎曲等帶型，影響檢測(cè)結(jié)果。
5 TAE與TBE緩沖液的選擇
TAE緩沖液推薦用于分析分子量大于1500bp的DNA-pian段和超螺旋DNA條帶；TBE緩沖液推薦用于分析分子量小于1500bp的DNA-pian段和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。大片段DNA分子在TBE緩沖液中無(wú)法*分離。
6 DNA電泳常見(jiàn)問(wèn)題分析及解決方案
