植物組織培養(yǎng)常見問題解析

1. 培養(yǎng)基的配制注意事項(xiàng)

植物組織培養(yǎng)蕞常用到 MS 培養(yǎng)基，包含十幾種化合物。因?yàn)橛行┗衔锵嘤鰰?huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，影響培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分，準(zhǔn)備 MS 培養(yǎng)基需要配制多種高倍母液。且配制母液時(shí)，尤其涉及大量元素的母液時(shí)，一定要等一種成分溶解之后，再緩慢的添加另一種成分，切記「一鍋煮」，即不能將各種化合物一齊添加進(jìn)去。可選用 Coolaber 的 MS 培養(yǎng)基基鹽（PM1011）在自行加入蔗糖和瓊脂配制 MS 培養(yǎng)基，既經(jīng)濟(jì)，更高效。

2. 滅菌后培養(yǎng)基不凝膠或者凝膠偏軟

植物凝膠、瓊脂都對(duì)酸性條件敏感，pH 值低于 5 很難成膠或凝膠偏軟，切記高壓滅菌前調(diào)節(jié)培養(yǎng)基 pH 值（5.5 - 6.0）。植物凝膠對(duì)二價(jià)陽離子濃度有要求，也就是相對(duì)于 MS 培養(yǎng)基，1 / 2MS 培養(yǎng)基中植物凝膠要適當(dāng)增加用量。另外滅菌后，倒出培養(yǎng)基前一定將培養(yǎng)基搖勻（帶防燙手套），因?yàn)槭黔傊芏却蟮讓雍扛?，容易造成培養(yǎng)基強(qiáng)度不均勻。選擇 Coolaber 改良 MS 培養(yǎng)基（PM10121，pH5.8±0.2）含蔗糖和瓊脂/植物凝膠，可以省去調(diào) pH 步驟。

3. 水解酪蛋白有酸水解和酶水解之分，在使用過程中有無區(qū)別？

水解酪蛋白對(duì)胚狀體、不定芽的分化有良好的促進(jìn)作用，通常用量在 500 mg/L，不管是酸解還是酶解，作用都是一樣的，酶解更有利于發(fā)揮其作用。

4. 怎么溶解組培常用植物激素？

IAA、IBA、GA、玉米素、多效唑等應(yīng)先溶解于少量 95% 的乙醇中，再加水定容配制成母液；如有結(jié)晶析出，可考慮用 1 / 10 體積的乙醇溶解后再定容；2，4 -D 易溶于堿性水溶液，可用少量 1mol/L 的 NaOH 溶液溶解后再慢慢加水定容；KT 和 6 -BA 先用少量的 HCL 溶解，再加水定容到一定的濃度。

5. 細(xì)胞分裂素使用濃度？

一般情況下在培養(yǎng)基中加入 0.1～10.0 mg/L 的細(xì)胞分裂素（6 -BA/KT/ZT)，多數(shù)用 1.0～2.0 mg/L，KT 濃度為 0.5～2 mg/L，這個(gè)也要根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料來調(diào)整。細(xì)胞分裂素可以單獨(dú)使用也可以與細(xì)胞生長(zhǎng)素配合使用。

6. 哪些植物激素能高壓滅菌，哪些不能高壓滅菌。

IBA、NAA、6 -BA、2,4 -D 可高溫高壓滅菌。 IAA、GA3、茉莉酸等不可高溫高壓滅菌，否則會(huì)分解失效，該類植物激素配制母液后需用 0.22 微孔濾膜過濾除菌，待培養(yǎng)基冷卻（50 - 60℃）后尚未凝膠前加入混勻。

7. 培養(yǎng)基的 pH 值會(huì)凝膠硬度有無影響。

有影響。若將培養(yǎng)基 pH 值調(diào)的過高（大于 6），則培養(yǎng)基偏硬，增加接種的阻力，會(huì)對(duì)外植體造成損傷。若將培養(yǎng)基 pH 值調(diào)的過低（小于 4.5），則培養(yǎng)基不能凝固，起不到固定外植體的作用。一般將培養(yǎng)基的 pH 調(diào)節(jié)至 5.5～6.0 為宜。

8. 滅菌過程會(huì)否影響培養(yǎng)基的 pH 值？

培養(yǎng)基中的蔗糖和激素在高溫滅菌過程中容易酸化，培養(yǎng)基 pH 值滅菌后會(huì)有所下降，滅菌前培養(yǎng)基的 pH 值偏低可能導(dǎo)致培養(yǎng)基不凝或偏軟。要求偏酸性的培養(yǎng)基可適當(dāng)增加瓊脂或植物凝膠的用量。

9. 應(yīng)用 75% 的酒精進(jìn)行種子消毒的過程中需要注意的問題

種子在消毒過程中使用 75% 的酒精使用應(yīng)慎重，酒精滲透力*，消毒時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)直接影響種子發(fā)芽率，所以建議消毒時(shí)間不應(yīng)超過 1 min。

10. 原始繁殖材料的消毒

組培中，作為原始繁殖材料的外植體消毒，直接影響整個(gè)培養(yǎng)過程的進(jìn)行。從室外采回來的外植體需進(jìn)行消毒，首先用自來水沖洗外植體，沖洗時(shí)間可根據(jù)采集部位不同而定，一般在 5～15 分鐘即可；關(guān)鍵在于在超凈臺(tái)中進(jìn)行藥劑的處理，常用的藥劑處理有 70% 的乙醇溶液、9% 的次氯-酸鈉溶液、和 0.1～0.2% 的升-汞溶液，具體可根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料而定。應(yīng)注意的是經(jīng)升-汞滅菌的外植體必須用無菌水沖洗 6～8 次。

11. 怎么處理植物組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的各種污染？

植物組織培養(yǎng)過程中的污染來源主要分為 3 種，真菌、細(xì)菌和組織培養(yǎng)過程中的污染源。在操作過程中，難免有菌落入培養(yǎng)基或植物材料上，而導(dǎo)致污染。另外，不正確操作也會(huì)增加污染機(jī)率。預(yù)防措施：通風(fēng)，保持室內(nèi)空氣干燥，紫外殺菌等。污染物品和污染培養(yǎng)基不要在培養(yǎng)室近距離開瓶洗刷。