加、減、換一個載體 的MCS的位點 （給一個表達 載體加、減、換小表達標簽，如His6， His10，strep II等，和MCS改造是一樣的），其實技術(shù) 不是問題，問題在于位點的選擇 ，因為載體設(shè)計 時應(yīng)該設(shè)計者也考慮過mcs的問題，應(yīng)該給使用者越多的選擇越好，但為什么有的載體只給有限的幾個位點呢，一可能是這個載體其他部位本身含有的限制性切點比較多，因而MCS位置的選擇比較少，二就是設(shè)計者是自用的載體，沒有考慮到我們的感受 。

因此如果你要加、減、換MCS，可以按一下幾個步驟進行：

1、找到載體全序列 ，查找有沒有你想要加的位點（Primer premier5……一堆軟件 ，再不濟了用word），如果沒找到你想加、減、換的位點，恭喜了，革命要成功了；

2、方法上不太推薦點突變或其他以overlap PCR 為基礎(chǔ)的技術(shù)，推薦小片段 克隆 ，也就是做shRNA 載體的那種方法，人工合成（按引物 合成）你想要的MCS序列的正反鏈，兩端加上載體上兩個切點的粘末端序列，人工退火（95度10min，然后每分鐘降5度直至Tm值下5度，維持10min，即可），不用電泳檢驗，直接按克隆的連接體系將這個小片段與你的載體（相應(yīng)酶雙切）連接轉(zhuǎn)化……

小片段連入的效率相當(dāng)高，如果大家要檢驗：在菌長出來后，做PCR檢驗（人工合成的這個小片段的正鏈或反鏈與載體上的引物）。舉個例子：

比如要在某載體的EcoR I和BamH I之間加一個新的MCS（EcoR V－Kpn I－Xho I－Hind III）（這幾個位點必須在目的 載體上沒有，如果有這個切點，你又實在想用的話，可以將目的載體用這個酶單切，綠豆芽核酸 酶/s1核酸酶平端化，再自連——位點封閉）：

1、合成 5‘－AATTC GATATC NNN GGTACC NNN CTCGAG NNN AAGCTT G-3'3'－G CTATAG NNN CCATGG NNN GAGCTC NNN TTCGAA CC TA G-5'

EcoR I粘末端  EcoRV      Kpn I                  Xho I               Hind III    BamH I粘末端 ； （這里面有幾個要點，合成時直接合成粘末端，省得再切，這樣既省合成的錢，效率又高，如果你需要在改造后的載體繼續(xù)使用原載體的連入切點，比如上面例子的EcoR I和BamH I，你像例子中一樣可以合成完整的酶切位點粘末端，如果你不想使用它們，那就只合成粘末端，比如上面那個例子，應(yīng)合成5-AATT GATATC ……和3’-CTATAG ……這樣連接后，EcoR I切點就被封閉了；再有要注意考慮連入位點之間要留一定的間隔，因為靠著的兩個酶是很難雙切開的，有時候分步切都沒用，因為留給酶結(jié)合的空間太小，沒法結(jié)合l ，一般按照相鄰兩個酶的推薦保護堿基數(shù)中較大的數(shù)目留，*?。?/p>

2、退火，如上；

3、克隆，同上；

4、檢驗，同上。測序，收工。

突變可以考慮，但如果載體太長了，做點突變越不容易，一方面比較難延伸，另一方面，即使延伸了，其他點突變的幾率也會比較大，但誰知道呢？有時候要靠一點運氣。如果想突變也是可以。

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